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      血液里的循環(huán)DNA是可以指導抗癌治療的，不過前提是科研人員們先研究出來如何才能夠最好地利用這些分子。

      2012年，Charles Swanton不得不直面腫瘤最“卑劣的”詭計。Swanton是英國倫敦癌癥研究所（Cancer Research UK London Research Institute）的科研人員，他們團隊對大量的腎癌樣品進行了DNA測序研究工作，希望能夠找到一些新的突變位點，但是單單在一個腫瘤里發(fā)現(xiàn)的遺傳變異就讓他們徹底驚呆了，他們沒想到能夠發(fā)現(xiàn)這么多的突變。在一個腫瘤組織里，一個部位的細胞就和另外一個位置上的細胞完全不一樣，在同一個組織中，只有大約1/3的突變是所有腫瘤細胞共有的突變�；颊呱眢w里其他位置上的轉移癌也與原發(fā)灶完全不同。

       這一研究結果證明，過去被我們看作是腫瘤診斷金標準的組織活檢（tissue biopsy）檢查也是遠遠不夠的，這就好像通過對一條街道的調查來推測整個國家的情況一樣可笑。組織活檢會漏掉很多信息，比如離活檢部位幾厘米之外的組織信息就無法檢測到，但是這些信息可能就會決定患者的生死。雖然組織活檢可以給我們提供一些腫瘤特異性的突變信息，根據這些信息也有可能找到效果比較好的抗癌治療手段和措施，但是這些信息都只是“靜態(tài)的”信息，不能夠準確地反映整個腫瘤組織的全貌。

       Swanton等人的研究成果更是讓腫瘤遺傳變異性變成了一道不可逾越的鴻溝。Swanton表示：“坦率的說，我們對此結果感到非常的沮喪，如果我們使用分辨率更高一些的檢測方法，會發(fā)現(xiàn)腫瘤的遺傳復雜性實際上更加超出我們的想象�！�

      不過科研人員們也找到了一些辦法，對患者體內的腫瘤有了更加豐富的了解，甚至能夠對這些腫瘤跟蹤一段時間。當腫瘤細胞死亡、裂解之后，它們會釋放出細胞內的物質，其中就包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA, ctDNA），即在人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的腫瘤基因組片段DNA。正常細胞的碎片通常都會被巨噬細胞（macrophages）等“清道夫細胞（cleaning cell）”吞食、清理掉，但是腫瘤細胞往往都比較大，而且增殖迅速，所以清道夫細胞都難以將腫瘤細胞徹底吞食、消化掉。

      科研人員們經過不斷的努力，開發(fā)出了能夠對循環(huán)腫瘤DNA進行檢測，并測序的新技術。這樣就將一瓶瓶血樣變成了液體活檢標本（liquid biopsies），而且與傳統(tǒng)的組織活檢技術相比，這種液體活檢能夠更加全面地反映腫瘤的特征。而且在一段時間之后重復進行液體活檢還可以了解抗癌治療是否起效，或者腫瘤是否出現(xiàn)耐藥性等多種信息。

       不過和以前一樣，這種新技術也有其局限性。ctDNA的水平有非常大的個體差異，而且很難檢測，在疾病初期，腫瘤體積還較小時尤其明顯。另外，到目前為止，開展的相關研究基本上都只是選擇了幾個，或者幾十個患者進行實驗，而且關注的腫瘤類型也比較有限，只是那幾種疾病而已。雖然這些實驗的結果都很不錯，但是還需要進行更大規(guī)模的研究，驗證這種ctDNA檢測方法是否能夠真實地反映出最準確的腫瘤信息。更重要的一點是，還需要進行更大規(guī)模的研究來驗證這種方法是否真的能夠挽救癌癥患者的生命，或者改善他們的生存質量。美國馬里蘭州約翰霍普金斯大學（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的腫瘤學家Luis Diaz就認為：“僅僅監(jiān)測腫瘤還遠遠不夠，我們現(xiàn)在面臨的問題是找到這種技術最切實有效的應用途徑�！�

      美國約翰霍普金斯大學的遺傳腫瘤學家Victor Velculescu也認為，如果科研人員能夠全部解決以上這些問題，那么液體活檢技術就可以幫助臨床醫(yī)生們選擇更好的治療方案，而且在治療過程中及時做出調整�！岸�且這種新技術還可以幫助我們找到新的抗癌治療靶點。讓個性化醫(yī)療成為現(xiàn)實，這是一個徹底改變游戲規(guī)則的新技術�！� Velculescu這樣說道。

      遲來的行動

       早在1948年就有人報道過在人體的血液中存在循環(huán)DNA，到了1977年，又有人指出在腫瘤患者的血液中更加容易發(fā)現(xiàn)循環(huán)DNA。可是又花了17年，我們才發(fā)現(xiàn)這種攜帶了突變信息的循環(huán)DNA是腫瘤的標志，因為科學家們證明這些DNA的確來自體內的腫瘤細胞。

      可是世界上第一個使用循環(huán)DNA的卻不是腫瘤學家。中國香港中文大學（Chinese University of Hong Kong）的化學病理學家Dennis Lo第一個想到，既然腫瘤能夠釋放DNA入血，那么胎兒肯定也可以。1997年，Lo成功地證明一個孕婦的外周血液中含有來自她體內男性胎兒的Y染色體。這一發(fā)現(xiàn)讓醫(yī)生們能夠在妊娠初期就可以鑒別出胎兒的性別，也可以不使用侵入式檢查方式（invasive testing）查出胎兒是否患有唐氏綜合癥（Down’s syndrome）等發(fā)育疾�。╠evelopmental disorders）。這對整個產前診斷（prenatal diagnostics）領域都是一場革命。

      英國劍橋癌癥研究院（Cancer Research UK Cambridge Institute）的基因組學專家Nitzan Rosenfeld指出，不過腫瘤更難被‘抓住’。其中一部分原因就是因為和胎兒循環(huán)DNA相比，腫瘤循環(huán)DNA更難以被檢測到。通常來說，血液里的循環(huán)腫瘤DNA更少，而且數(shù)量變異度非常大。對于極晚期癌癥患者，腫瘤組織是他血液中循環(huán)DNA的主要來源，但是一般情況下，ctDNA只占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%。早期的基因測序技術是無法測定這么微量的DNA的，至少在測序的穩(wěn)定性和可靠性方面還不足以讓循環(huán)DNA成為一種生物標志物。

      近十年來，DNA測序技術有了飛速的發(fā)展，靈敏度得到了大幅提升，已經能夠檢測到痕量的DNA分子，并且對其進行定量分析。比如，借助BEAMing這種DNA擴增技術就可以檢測到每1萬個健康細胞DNA中的那一個ctDNA分子。這種BEAMing技術可以將循環(huán)DNA吸附到磁珠上，然后將其分離并進行檢測。

      美國約翰霍普金斯大學的遺傳腫瘤學家Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler也開發(fā)出了一種新技術，他們在2007年發(fā)表論文，介紹了對18名正在接受治療的腸癌患者的檢測結果，他們使用這種新技術對這些患者體內的ctDNA進行了跟蹤研究。結果發(fā)現(xiàn)，手術治療之后，患者體內的ctDNA水平降低了99%，但是有些病人體內的ctDNA并沒有完全消失。在第一次隨診時還是能夠檢測到體內ctDNA信號的患者中，除了1人之外，其他的所有人最后都出現(xiàn)了腫瘤復發(fā)的情況。不過在術后檢測不到ctDNA的患者中則沒有一例復發(fā)。

      這些結果表明，ctDNA能夠告訴我們，手術治療對患者的治療效果如何，患者在術后是否需要接受化療，殺死殘余的腫瘤細胞等等信息。隨后，科研人員們也對其它多種腫瘤患者進行了同樣的研究，也得到了非常類似的結果。Rosenfeld與他在英國癌癥研究院的同事James Brenton 和Carlos Caldas一起發(fā)現(xiàn)，ctDNA能夠準確地揭示晚期卵巢癌和乳腺癌的特性。在一項迄今為止規(guī)模最大的科研項目中，Diaz和美國約翰霍普金斯大學的其他幾名同事一起發(fā)現(xiàn)，在患有胰腺癌、膀胱癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、肝癌和頭頸部腫瘤等各種癌癥的晚期患者人群中，至少有75%的患者能夠檢出ctDNA。不過腦癌（Brain cancers）是一個比較值得一提的例外，因為血腦屏障的原因，顱內腫瘤的DNA無法進入外周血液循環(huán)當中。

      更好的生物標志物

      數(shù)十年來，科研人員們一直都在尋找能夠很好地反映腫瘤情況的生物標志物，與蛋白質類生物標志物相比，循環(huán)DNA的表現(xiàn)應該會更好。在臨床工作中，蛋白質已經被用來診斷疾病，或者監(jiān)測治療效果。比如前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）就是前列腺癌的生物標志物。但是PSA檢測會出現(xiàn)假陽性結果，因為也有其它原因會導致血液中的PSA增加�？墒莄tDNA檢測出現(xiàn)假陽性結果的可能性就要低得多，因為我們不是檢測ctDNA的水平，而是檢測它是否攜帶有腫瘤特異性的突變，或其它基因組改變信息。另外，大部分蛋白質類生物標志物都可以在血液中存留數(shù)周的時間，但是ctDNA的半衰期卻還不到2小時，所以能夠更加明確地反映出腫瘤近期的信息，而不是很久以前的情況。英國劍橋和美國約翰霍普金斯大學的科研團隊已經分別發(fā)現(xiàn)，在檢測乳腺癌和腸癌方面，ctDNA要比蛋白質類生物標志物更加靈敏，而且在追蹤腫瘤轉歸、轉移和復發(fā)方面，ctDNA的準確度也更高。

      美國和英國的這兩個科研團隊還發(fā)現(xiàn)，ctDNA要比循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumour cell）更加靈敏，所謂循環(huán)腫瘤細胞指的就是在血液循環(huán)系統(tǒng)中的完整腫瘤細胞，這也是一大研究熱點。Diaz等人在一個16人的亞組研究工作中發(fā)現(xiàn)，當同時能夠檢出ctDNA和循環(huán)腫瘤細胞時，ctDNA的數(shù)量是循環(huán)腫瘤細胞的50倍。而且能夠檢出循環(huán)腫瘤細胞就一定可以檢出ctDNA，但是有13個人卻只能夠檢出ctDNA，而找不到循環(huán)腫瘤細胞。

      不過Diaz認為，ctDNA檢測最讓科研人員們激動的還是它能夠跟蹤腫瘤的演變和轉歸，他說道：“該技術能夠幫助我們回答很多在之前一直找不到答案的腫瘤學問題�！�

      比如，為什么有那么多靶向治療藥物最終都是以失敗告終？吉非替尼（Gefitinib）和帕尼單抗（panitumumab）就是著名的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）抑制劑類靶向治療藥物，我們都知道EGFR是一種涉及細胞生長和分裂的蛋白質，在多種腫瘤細胞中都有過度活化的現(xiàn)象�；颊呤褂眠@類藥物治療之后最開始都會獲得非常明顯的治療效果，但是幾個月之后就會出現(xiàn)耐藥的情況，最常見的情況就是因為KRAS基因（該基因在多種腫瘤中都會出現(xiàn)突變）發(fā)生改變。

      在臨床上，為了監(jiān)測患者的病情，并且決定下一步的治療方案，臨床醫(yī)生們往往需要進行多次組織活檢。但是晚期癌癥患者體內卻經常有多個腫瘤組織需要活檢，而且一個腫瘤組織的不同部位往往也會表現(xiàn)出不同的耐藥特性。這種組織活檢是一種侵入式的、有創(chuàng)的檢查手段，操作上存在一定的風險，而且像肺臟等較脆弱的組織也很難進行組織活檢檢查。所以Velculescu認為，患者治療失敗之后，你不能夠跟病人說，我們再做5次活檢吧。但是采血進行液體活檢可就簡單多了。

      2012年，Diaz的課題組報道了他們使用ctDNA技術對接受EGFR抑制劑類藥物治療的腫瘤患者進行研究的結果。他們一共發(fā)現(xiàn)了42種不同的，與耐藥相關的KRAS基因突變，平均來說，ctDNA技術能夠比影像學檢查提早5個月發(fā)現(xiàn)腫瘤的進展情況。Diaz他們重點觀察的是KRAS基因突變，而Rosenfeld等人在用ctDNA技術尋找耐藥突變時則沒有預設的目標。去年，Rosenfeld的課題組介紹了他們對6名正在接受治療的晚期乳腺癌、肺癌、或卵巢癌患者血樣開展的全外顯子組（即基因組中負責編碼蛋白質的序列，在整個基因組中大約占到1%）測序研究工作。其中有5個病例都發(fā)現(xiàn)了耐藥機制，比如有外顯子發(fā)生突變，導致抗癌藥不能與靶蛋白結合，所以出現(xiàn)耐藥。

      盡早發(fā)現(xiàn)耐藥情況可以幫助臨床醫(yī)生們避免給患者使用昂貴、有毒副作用，而且治療效果也不好的藥物。通過發(fā)現(xiàn)這些耐藥突變，就可以找到其他的有效方案，或者制定出組合治療方案。Velculescu說道：“我們有望將癌癥這種致死性的疾病變成一種慢性疾病。我們可以選擇一種抗癌藥進行治療，等這種藥物失效之后，我們再換另外一種藥�！�

      臨床應用上的限制

      盡管ctDNA技術的前景非常光明，但是目前還不太適合應用于臨床。因為目前最靈敏的ctDNA檢測技術，比如BEAMing等技術依賴的都是已經非常明確的待測突變。但是這些突變信息還是只能通過組織活檢的方法才能夠獲得。也就是說，我們只能先進行組織活檢，對標本進行測序，發(fā)現(xiàn)突變位點信息之后，根據這些突變信息設計出特異性的探針，然后才能夠進行ctDNA液體活檢。每一個病人都得經歷這一過程。不過也可以像Rosenfeld等人那樣進行全外顯子組測序。這就不需要預先知道突變信息，但是目前進行這種測序的成本非常高，還不太現(xiàn)實。

      美國斯坦福大學（Stanford University in California）的腫瘤放療專家Maximilian Diehn嘗試過將這兩種研究策略結合到一起。他們發(fā)現(xiàn)在肺癌患者的基因組中，有一小部分（只有0.004%）片段總是會出現(xiàn)突變。所以他們只要拿到一份新的肺癌患者血樣，就會對這個片段進行檢測——1萬多次測序。這樣就可以發(fā)現(xiàn)非常罕見的突變，而且檢測成本會大大降低。Diehn認為，因為差不多每一名肺癌患者基因組中的這個區(qū)域至少都會存在1種突變，所以這種方法適用于每一位肺癌患者。他們課題組現(xiàn)在正在對其他類型的腫瘤開展研究，希望找到類似的突變位點，并且進行臨床實驗，驗證他們的發(fā)現(xiàn)，不過這還需要好幾年的時間。

      與其他的ctDNA活檢技術一樣，Diehn的這種方法對于早期腫瘤患者的檢測效果也不太好。在一項小型研究中發(fā)現(xiàn)，這種技術對于2期及更晚期的患者具有100%的檢出率，但是對于1期患者，檢出率只有50%。這也很容易理解，因為晚期腫瘤釋放的ctDNA更多，但是這的確限制了ctDNA檢測技術在臨床上的應用，使其還不能夠成為一種癌癥篩查手段。

      Diehn認為，靈敏度更高的檢測技術可以解決這個問題，不過Diaz卻不贊成這個觀點。Diaz說道：“限制因素是生物學本身。在循環(huán)血液中就沒有足夠的DNA片段。如果ctDNA檢測提示我們，體內存在腫瘤，那又如何呢？因為即便在血液中檢出了腫瘤突變，我們還是不知道原發(fā)灶在哪啊�！�

      此外，還存在其他的不確定因素。比如ctDNA能夠真實地反映出腫瘤的特性嗎？腫瘤轉移灶細胞也會釋放出和原發(fā)灶一樣多的ctDNA嗎？腫瘤組織中的每一個腫瘤細胞是否都會釋放出同樣多的ctDNA？Diaz認為要找到這些問題的答案，唯一的方法就是進行“死亡后及時尸檢（warm autopsies）”，在患者死后的第一時間將患者體內的腫瘤組織取出，進行分析，并且將分析結果與ctDNA檢測結果進行比對�！斑@是我們接下來將要開展的重要工作。” Diaz說道。

      可是最大的問題還是沒有解決，ctDNA檢測能否準確地反映體內的腫瘤負荷（tumour burden），能否實時的再現(xiàn)新發(fā)的突變，真的能夠挽救患者的生命，或者改善患者的生存質量？即便臨床醫(yī)生們發(fā)現(xiàn)患者體內的腫瘤出現(xiàn)了耐藥突變，如果沒有針對這種突變的藥物，醫(yī)生們也還是束手無策。所以Velculescu認為，最大的困難還是在靶向治療藥物方面。就算你掌握了所有信息，又能怎么辦？我們對于腫瘤的研究手段已經遠遠地領先于臨床醫(yī)生們在實際工作中的需要，他們現(xiàn)在手頭上可供選擇的治療方案還非常少。

      即便ctDNA檢測目前還不能夠改變癌癥患者的預后，科學家們還是將這種技術看作是一個非常重要、非常有價值的科研手段。臨床醫(yī)生們也已經開始將收集ctDNA標本當作了一項臨床常規(guī)操作。比如Swanton就正在領導一個投資1400萬英鎊，約合2400萬美元，名為“在治療中跟蹤腫瘤演進（Tracking Cancer Evolution Through Therapy, TRACERx）”的肺癌研究項目。他們將使用傳統(tǒng)的組織活檢技術和每3個月一次的ctDNA檢測技術開展研究。循環(huán)DNA有可能會（也可能不會）給我們提供有價值的線索，對患者進行研究。但是無論如何，至少可以讓Swanton更清晰地了解和認識肺癌的演進過程，以及如何控制腫瘤的演進。

      Rosenfeld也認為，有這種信息總比沒有好。他最近表示：“我們正在黑暗中摸索。如果你有辦法看到黑暗中正在發(fā)生什么，為什么不用呢？”